Making the actual CRISPR fluid!!

이제 드디어 박테리아의 유전자를 편집할 시간!!

To make the CRISPR solution, it is required to make the bacterial transformation mix, which will serve as a base. To make the bacterial transformation mix, a small portion of the bacteria grown in the LB Agar has to be dissolved into the bacterial transformation solution.

크리스퍼 액체를 만들려면 먼저 베이스로 사용할 박테리아 액체를 만들어야 돼요. 박테리아 액체를 만들려면 이미 LB Agar 접시에 자란 박테리아를 멸균루프로 긁어서 모은 다음, Bacterial Transformation Mix라는 액체에 박테리아를 녹아야 돼요.

I followed the instruction manual by adding 100μl of the bacterial transformation fluid into a new microcentrifuge tube. However, I struggled a bit in the next step of scraping the bacteria off with an Inoculation loop. Since not a lot of bacteria had grown in my LB Agar plates, not only did I not know how much bacteria was supposed to be scraped off in the loop, but also, there was not enough bacteria to scrape off. I was scared that scraping off the bacteria until it filled the Inoculation loop might’ve scraped all the bacteria off and thus, preventing further growth and expansion of the bacteria.

The instruction manual said to scrape the bacteria off until it filled the loop of the Inoculation loop stick, but no matter how much bacteria I scraped off, the bacteria just built on top of itself and didn’t fill the loop.

사용설명서를 보고 똑같이 Bacterial Transformation Mix액체 100μl를 새 용기에 담았어요. 하지만, 멸균 루프로 박테리아 긁을 때 문제가 일어났어요. 사용설명서에서는 루프가 완전히 다 채워질 때까지 긁으라고 했는데, 아무리 긁어도 박테리아가 루프 안에 채워지는게 아니고, 점점 루프 뒷부분에 쌓이기만 해서 당황했어요. 뿐더러, 박테리아가 전에 많이 안 자라서 긁을 박테리아도 많이 없었어요.

When I inserted the Inoculation loop into the microcentrifuge tube, it took a while for the bacteria to fall off the loop and actually dissolve. And when it did, the bacteria had fallen to the end of the microcentrifuge tube tip, which was smaller than the diameter of the Inoculation loop. I had to flip the loop around so that the smaller loop was able to fit into the tube and dissolve the bacteria.

어쩔 수 없이 박테리아를 긁은 다음 루프에 있는 박테리아를 Bacterial Transformation Mix 용기에 녹아야 되는데, 루프의 지름이 용기의 지름보다 더 커서 루프 자체가 안 들어갔어요. 그래서 못 녹이고, 루프를 거꾸로 회전시킨 다음, 더 작은 루프로 엄청 열심히 긁고 섞었어요. 녹이는데 너무 오래걸려요..

Now time to prepare the Cas9 DNA! The three tubes for making the CRISPR solution were also stored in the fridge(by accident), so the sterile water that was provided too, was also frozen. I rubbed the bottle between my hands, and the sterile water melted quite quickly.

이제 CRISPR액체를 만들 때 주요 재료: Cas9 DNA!! 크리스퍼 액체를 만들 때 사용하는 액체가 세가지가 있어요(그중에 Cas9 DNA 포함). 이 세가지 액체도 실수로 냉동고에 보관해서 다 얼었어요^^ 이 액체들을 멸균수에 섞어서 녹여야 되는데 다 얼었지 뭐에요^^ 그래서 손바닥 사이에 끼고 비볐더니 꽤나 빨리 녹았어요.

To prepare the Cas9 plasmid, gRNA plasmid, Template DNA, I had to add 55μl of sterile water to each plasmid/DNA tube. However, since I was already confused with the actual pipette methods, I just assumed that the sterile water would fill up to 5μl(basically halfway through the first demarcation line). This obviously caused inaccuracy in my results, but I did not know how to solve this problem…

이 세가지 액체의 이름들은 Cas9 plasmid, gRNA plasmid, Template DNA에요. 아무래도 박테리아의 유전자를 바꿔야하니, 액체 이름에 DNA/RNA랑 관련된 용어가 많죠? Cas9 plasmid, gRNA plasmid, Template DNA를 준비하려면 각 용기에 멸균수 55μl를 넣어야 돼요. 하지만, 여태까지 십단위로 넣어서 쉬웠는데, 일단위도 나오니, 많이 당황했어요. 10μl를 넣으려면 그냥 첫선까지 빨면 되는데, 5μl라니! 대충 눈으로 이정도면 5μl이겠지?라고 예측하고 55μl의 멸균수를 용기에 넣긴했는데… 잘 모르겠어요. 이 ‘대충 넣어야지’라는 생각 때문에 실험 망칠 확률이 더 높아졌던 것 같아요.

Additionally, in the instruction manual, it stated to add the plasmid/DNA + sterile water mixture to my “competent cell mixture” and I did not certainly know whether they were referring to the bacterial transformation mix I had made, or something else. I wish they had clearer instructions.

그리고, 사용설명서가 솔직히 말해서 너무 불분명해요. 정확히 무슨 액체를 써야하는지 이름을 대야 되는데, “유능한 세포 혼합물”이 도대체 뭔말이에요? 문법도 이상하고 아예 말이 안되는데 액체 이름보다는 액체를 그냥 설명하기만 해서 도대체 뭔 액체를 가리키고 있었는지 잘 몰랐어요.. 제발 더 명확한 설명서를 써줬으면..

I was scared to use the fridge again because of my previous mistake, so when incubating the tube under a cold condition, I stuck the bacterial transformation mix+DNA mix microcentrifuge tube under several blocks of ice.

Cas9 plasmid, gRNA plasmid, Template DNA를 이미 만든 Bacterial Transformation Mix 용액에 섞는 걸로 대충 예측했어요.. 정확히 Bacterial Transformation Mix을 가리키는진 모르겠다만…

전에 일렀던 실수처럼 다시 냉동고에 배양하기 무서워서 Cas9 plasmid, gRNA plasmid, Template DNA랑 Bacterial Transformation Mix를 섞은 용액을 담은 용기를 통에 담고, 그 위에 얼음을 엄청 많이 올렸어요.

When incubating the tube in the warm condition, the instruction manual stated to use very warm water, but I did not know how approximately “comfortably warm” was, so I waited for the water to cool down and I think I waited too long for it to cool. It was on the brink of room temperature water, which I don’t think the instruction manual wanted me to do.

얼음에 충분히 배양시킨 후, 따뜻한 물(42°C)에 배양해야 된다고 했는데 저희 집에 온도계가 많이 없고, 그리고 있어도 뭔가 쓰기가 찝찝해서 그냥 손으로 대충 예측했어요. 설명서에서는 손을 오랫동안 담글 수 있을 정도의 따뜻한 온도라고 했는데 이것도 사람에 따라 달라서 끓인 물을 아~주 오랫동안 식혔어요. 좀 심하게 많이 식힌 것 같기도 해요..

I added the LB Agar media sucessfully, and while adding 250μl of the LB media to my cell mixture, I got lost counting to 25, and I think I might have added less than 250μl for the first trial..

LB Agar Media는 성공적으로 물을 흘리지 않고 잘 넣었는데요.. 문제는 물에 녹인 LB Agar Media를 크리스퍼 액체에 250μl를 넣어야 되는데… 피펫팁의 첫선이 10μl이니까 25번을 넣으면 된다고 생각해서 25번 넣는다고 세고 있다가 갑자기 전화가 와가지고 몇번째였는지 까먹었어요. 아마도 넣어야 되는 양보다 더 적게 넣은 것 같아요..

I left the microcentrifuge to incubate for 24 hours.

크리스퍼 액체가 배양되도록 1일동안 냅뒀어요.

The next day, I added all my cell mixture to a LB Strep/Kan/Arabinose Agar plate, but I felt this gut feeling that I was probably going to lack a lot of the solution when making the cell mixture again for the other LB Strep/Kan/Arabinose Agar plates, so I got an Inoculation loop and picked up the cell mixture in the Petri dish and spread the mixture to 2 other plates. I should have not done this.. But I was scared I was going to lack the solution later on and continued.

다음날, 배야하게끔 냅뒀던 크리스퍼 액체를 LB Strep/Kan/Arabinose Agar 접시 한개에 피펫으로 다 옮겼어요. 원래 LB Strep/Kan/Arabinose Agar 접시 하나당 크리스퍼 액체 하나 써야 되는데 왠지 크리스퍼 액체 만들면서 크리스퍼 액체 만들때 사용되는 재료들이 많이 부족할 것 같은 기분이 들어서 하면 안되지만, 멸균 루프로 LB Strep/Kan/Arabinose Agar접시에 담은 크리스퍼 액체를 퍼서 다른 두 LB Strep/Kan/Arabinose Agar 접시에 쓱쓱 발랐어요.

While waiting for the newly transformed bacteria to grow on the LB Strep/Kan/Arabinose Agar plates, I made three new CRISPR solutions. I used up all the Cas9 plasmid, gRNA plasmid, Template DNA solutions by the time I finished making the last CRISPR solution. However, I ran out of Template DNA solution when I was making the last CRISPR solution, which made me very worried.. I poured the solutions to each Petri dish, and waited for 24 hours for the bacteria to grow!

LB Strep/Kan/Arabinose Agar접시에 박테리아가 자라게끔 냅두고 크리스퍼 용액을 세개 더 만들었어요. 마지막 액체 만들때 Cas9 plasmid, gRNA plasmid, Template DNA 액체를 다 썼어요. 그러나, 마지막 크리스퍼 액체를 만들 때 Template DNA가 좀 많이 모자랐어요, 그래서 좀 많이 걱정했어요. 각 페트리 접시에 붓고 박테리아가 자라게 24시간을 기달렸어요.

-Joanna Kim, July 3, 2020, 12: 00AM KST